Торговое название препарата: Химотрипсин
Международное непатентованное название:
ХимотрипсинЛекарственная форма:
Лиофилизат для приготовления раствора для инъекций и местного применения.Состав:
в 1 флаконе содержится в качестве активного вещества химотрипсин - 10 мг.Описание: Лиофилизированная пористая масса в виде таблетки, комочков или блестящих чешуек белого цвета.
Фармакотерапевтическая группа:
протеолитическое средство.Код ATX: D03BA
Фармакологические свойства.
Химотрипсин - ферментный препарат протеолитического действия, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Гидролизует белки и пептоны с образованием относительно низкомолекулярных пептидов, расщепляет связи, образованные остатками ароматических аминокислот (тирозин, триптофан, фенилаланин, метионин).
В медицинской практике применение химотрипсина основано на специфической особенности расщеплять некротизированные ткани и фибринозные образования, разжижать вязкие секреты и экссудаты, а при внутримышечном введении оказывать противовоспалительное действие.
Показания к применению.
Нагноительные заболевания органов дыхания (трахеиты, бронхиты, бронхоэктатическая болезнь, пневмония, абсцессы легких, ателектаз, экссудативный плеврит, бронхиальная астма).
При лечении ожогов, пролежней, гнойных ран, тромбофлебитов.
В офтальмологии - при свежих обширных тромбозах центральной вены сетчатки, острой непроходимости центральной артерии сетчатки, помутнениях стекловидного тела травматического и воспалительного происхождения, экстракции катаракты.
В отоларингологии - при гнойных синуситах, подострых ларинго-трахеитах, после трахеостомии для облегчения удаления густого вязкого экссудата, при острых, подострых, гнойных, хронических средних отитах и евстахиитах с вязким экссудатом.
Противопоказания
Повышенная чувствительность к химотрипсину, злокачественные новообразования, туберкулез легких (открытая форма), хроническая сердечная недостаточность II - III степени, дистрофия и цирроз печени, вирусный гепатит, панкреатит, геморрагический диатез, эмфизема легких с дыхательной недостаточностью.
Нельзя вводить в кровоточащие полости, наносить на изъязвленные поверхности злокачественных опухолей во избежание распространения злокачественного процесса.
С осторожностью.
Эмпиема плевры туберкулезной этиологии (рассасывание экссудата может в некоторых случаях способствовать развитию бронхоплевральной фистулы).
Применение при беременности и в период кормления грудью
Данных о применении препарата при беременности и в период кормления грудью нет.
Способ применения и дозы.
Для внутримышечного введения растворяют непосредственно перед применением 0,005 г препарата в 1 -2 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида или 0,5-2 % раствора прокаина. Курс лечения - 6-15 инъекций.
При заболеваниях органов дыхания препарат применяют внутримышечно в дозах по 5-10 мг в день в течение 10-12 дней, возможно сочетание с применением химотрипсина аэрозольно в 5% водном растворе в количестве 3-4мл. Через 7-10 дней курс лечения может быть повторен.
При лечении ожогов и пролежней химотрипсин в дозе 20 мг растворяют в 20 мл 0,25% раствора прокаина и тонкой иглой несколькими уколами вводится под струп. На гнойные раневые поверхности накладывают на 8 часов стерильные салфетки, смоченные раствором 0,025-0,05 г химотрипсина в 10-50 мл 0,25 % раствора прокаина. Для лечения гнойных ран внутримышечные введения препарата сочетают с местным лечением раны тампонами, смоченными 5% водным раствором химотрипсина.
При тромбофлебитах препарат назначается внутримышечно по 5-10 мг ежедневно в течение 7-10 дней.
При экстракции катаракты химотрипсин в разведении 1:5000 вводится в заднюю камеру глаза с последующим промыванием передней камеры глаза 0,9 % раствором натрия хлорида через 4 минуты после введения препарата.
При лечении тромбозов центральной вены сетчатки, острой непроходимости центральной артерии сетчатки химотрипсин вводится субконъюктивально по 0,2 мл 5% раствора, приготовленного на 1% растворе прокаина, 1-2 раза в неделю.
При синуситах препарат вводится в соответствующую полость в количестве 5-10 мг в 3-5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида после пункции и промывания полости.
При отитах закапывают в ухо по 0,5-1 мл 0,1% раствора химотрипсина на 0,9 % растворе натрия хлорида. При микрооперациях на ухе для размягчения фибринозных образований в среднем ухе во время операции вводят в полость 0,1% раствор химотрипсина. Одновременно химотрипсин следует вводить внутримышечно по 2,5-5 мг 1-2 раза в день. Препарат разводится в 1-2 мл 0,25-0,5% раствора новокаина или 0,9 % раствора натрия хлорида.
Побочное действие
Возможно появление аллергических реакций, повышение температуры тела до субфебриальной, тахикардии.
После ингаляционного введения: изредка наблюдается раздражение слизистых оболочек верхних дыхательных путей, охриплость голоса.
При субконъюнктивальном введении возможны раздражение и отечность конъюнктивы; в таких случаях рекомендуется уменьшать концентрацию применяемого раствора.
После внутримышечного введения могут возникнуть болезненность и гиперемия на месте инъекций.
Взаимодействие с другими лекарственными средствами.
Не описано.
Форма выпуска
Лиофилизат для приготовления раствора для инъекций и местного применения 10 мг (флаконы 5 мл). 10 флаконов вместе с инструкцией по применению в картонной пачке.
Условия хранения
В сухом, защищенном от света месте при температуре не выше +10°С. Растворы химотрипсина неустойчивы: могут храниться в течение суток при температуре 2-5°С.
Хранить в недоступном от детей месте.
Срок годности
3 года. Данное лекарство нельзя использовать после даты, указанной на упаковке.
Условия отпуска из аптек:
По рецепту.Название и адрес изготовителя
Изготовитель: Россия, 196158, Санкт-Петербург, Московское шоссе, 13 ООО "Самсон-Мед"
Латинское название:
Chymotrypsin
Код АТХ:
D03BA
Действующее вещество:
Химотрипсин
Производитель:
Самсон-Мед, РФ
Отпуск из аптеки:
По рецепту
Условия хранения:
t 0 — 10 градусов
Срок годности:
До 3 лет
Химотрипсин – порошок, который направлен на борьбу с патогенными белками, чем ускоряет процесс выздоровления от недугов системы дыхания. В составе одноименный активный ингредиент.
Показания к применению
Химотрипсин используется при следующих болезненных состояниях:
- Воспалительно-дистрофическая форма пародонтоза
- Воспаление стенки вены с образованием тромба
- Воспаление гайморовой пазухи носа
- Остеомиелит
- Воспаление радужной оболочки глаза
- Воспаления к разных частях уха
- Болезни бронхов и трахеи
- Экстракция катаракты.
Состав и форма выпуска
В химсоставе медикамента находится химотрипсин – основной рабочий компонент. Дополнительно необходимо было присоединение аспарагиновой к-ты, ферментов животного происхождения и серина.
Главный активный элемент представляет собой особый протеолитический фермент, продуцирующийся поджелудкой млекопитающих.
В медицине же используют фермент, полученный из железы крупного рогатого скота.
Химотрипсин представляет собой спрессованный мелкокристаллический кипенно-белый порошок без запаха и вкуса, который помещается в стеклянные герметичные ампулы. Последние укладываются на пластиковые прозрачные блистеры по 5 штук, в упаковке находится 10 доз. Дополнительно в коробке есть инструкция по применению.
Лечебные свойства
Химотрипсин – это средство, которое направлено на расщепление патогенных белков. Основной элемент синтезируется из животной поджелудочной железы.
Внутримышечное введение обеспечивает антивоспалительный эффект. Местное использование стимулирует расщепление некротизированных тканей, сгустков крови и тромбов. Средство хорошо справляется с мокротой и экссудатом.
Из-за работы препарата происходит расщепление соединений, образованных аминокислотами, а также осуществляется гидролиз белков.
Порошок имеет активное воздействие на организм при недугах дыхательных путей, образующих вязкую мокроту.
Способ применения
Порошок Химотрипсин инструкция советует разводить в 0,5- 2% новокаине или хлориде натрия. Инъекции ставят внутримышечно, т.е. в ягодицу.
Дозировка для взрослых на сутки – от 5 до 10 мг. Обычно курс составляет 10-12 дней. После этого через неделю или 10 дней лечение можно повторить. Подробную дозировку и схему назначит специалист, после исследований и результатов анализов.
Дополнительно медикамент разрешено использовать местно на гнойно-раневые поверхности. Для этого используют стерильные бинты или салфетки, смоченные в растворе химотрипсина (25-50г) и прокаина (10-50мл 0,25%). Время – 8 часов.
Порошок запрещен к приему будущими мамами и кормящими.
Противопоказания и меры предосторожности
Цена: 1000 руб
Препарат запрещен к приему, если у больного наблюдается одно или несколько нижеописанных состояний:
- Аллергия на основной или дополнительные ингредиенты ЛС
- Туберкулез в декомпенсированной форме
- Злокачественные опухоли, которые распадаются
- Кровоточащие раны
- Цирроз
- Инфекционный вид гепатита
- Геморрагический вид диатеза
- Воспаление поджелудочной железы
- Эмфизема
- Недостаточность сердца или дыхательной системы.
Внимание! Запрещен внутривенный ввод медикамента
Для лиц, страдающих тяжелой формой туберкулеза, препарат вводят постепенно, начиная с небольших доз.
Прием антигистаминных препаратов требует проведения предупредительных мер с целью выведения данных средств из организма.
Химотрипсин может оказывать негативное влияние на координацию и мозговую деятельность, поэтому люди, работающие со сложными механизмами или управляющие транспортом, должны соблюдать особую осторожность.
Побочные эффекты, передозировка, взаимодействие
Прием ЛС способен справоцировать развитие негативных эффектов:
- Жжение и чувство боли в месте инъекции
- Аллергии разных типов
- Тахикардия
- Отеки и раздражения конъюнктивы
- Открытие кровотечения из ран
- Малозначимое увеличение температуры.
Из-за низкой токсичности случаи негативного влияния на организм повышенных доз препарата не отмечались.
Химотрипсин, как и его аналоги, может снижать всасываемость железа, если последние принимаются параллельно с рассматриваемым средством.
Бронхорасширяющие препараты и антибиотики можно принимать одновременно с порошком.
Аналоги
Самсон-Мед, Россия
Цена: 950 руб
Трипсин назначается для терапии болезней дыхательной системы и некоторых недугов глаз и заживления ран. В основе лежит трипсин, который также извлекается из поджелудки крупного рогатого скота. Выпускается в виде порошка для инъекций.
Плюсы:
- Незначительно, но дешевле Химотрипсина
- Хороший эффект от терапии.
Минусы:
- Жжется при введении
- Имеет множество побочных эффектов.
ом участвует в протеолизе белков пищи в тонкой кишке Химотрипсин преимущественно расщепляет связи, образованные СООН-группами аминокислот, имеющими гидрофобные боковые цепи, и характеризуется более широкой специфичностью действия, чем . В отличие трипсина Х. створаживает молоко.
Химотрипсин вырабатывается экзокринными клетками поджелудочной железы (Поджелудочная железа) в виде неактивного профермента - химотрипсиногена, который секретируется в двенадцатиперстную кишку, где под влиянием трипсина превращается в химотрипсин. У человека и большинства млекопитающих обнаружены два вида химотрипсиногена - А и В, различающиеся по своим физико-химическим свойствам. В процессе активации химотрипсиногена А образуется несколько активных форм химотрипсина, различных по растворимости, форме кристаллов и величины ферментативной активности. Основной формой химотрипсина является химотрипсин А - белок с молекулярной массой около 25 000. максимально устойчив в слабокислой среде; в нейтральной и слабощелочной средах подвергается аутолизу. Оптимум действия Х. находится при рН 7,5-8,2.
Для определения активности Х. предложен ряд методов, основанных на расщеплении белков и синтетических субстратов. Широко используется контролируемый спектрофотометрически эфиров М-замещенного тирозина.
Активность Х. угнетается рядом синтетических и природных ингибиторов. В плазме крови и тканях присутствуют белковые ингибиторы Х., предохраняющие от разрушения этим ферментом. Многие из них поливалентны к угнетают также других протеаз (например, α 2 -макроглобулин, некоторые ингибиторы трипсина); специфическим ингибитором Х. в плазме крови является α 1 -антихимотрипсин.
Химотрипсин используется в качестве лекарственного средства, способного избирательно расщеплять белки некротизированных тканей, фиброзных образований, разжижать вязкие экссудаты, гнойные массы. Он оказывает противовоспалительное, противоотечное действие и способствует заживлению ран. Лекарственные препараты Х. получают из химотрипсиногена А, который выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота и после перекристаллизации активируют трипсином. В медицинской практике применяют химотрипсин А, выпускаемый под названием «химотрипсин кристаллический». Это белого цвета, хорошо растворимый в воде и в изотоническом растворе натрия хлорида.
Показания к применению, способы применения, дозы, и возможные осложнения такие же, как у трипсина кристаллического. Кроме того, X. применяют при интракапсулярной экстракции катаракты. Вместе с трипсином Х. входит в состав химопсина, панкреатина и некоторых других препаратов, используемых при недостаточности функции поджелудочной железы.
Форма выпуска: герметически укупоренные флаконы или ампулы, содержащие по 0,005 г (5 мг ) и 0,01 г (10 мг ) кристаллического химотрипсина. Хранение в защищенном от света месте при температуре не выше +10°.
II Химотрипси́нфермент секрета поджелудочной железы, относящийся к классу гидролаз (КФ 3.4.21.1), катализирующий гидролитическое расщепление белков, пептидов, амидов и сложных эфиров аминокислот при переваривании пищи в кишечнике.
1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .
Синонимы :Смотреть что такое "Химотрипсин" в других словарях:
Химотрипсин … Орфографический словарь-справочник
ХИМОТРИПСИН, вещество, вырабатываемое в организме, которое способствует перевариванию пищи. Химотрипсин представляет собою энзим, который расщепляет белки. Он вырабатывается в тонком КИШЕЧНИКЕ путем сложных химических реакций из химотрипсиногена … Научно-технический энциклопедический словарь
Пищеварительный фермент сока поджелудочной железы; участвует в расщеплении белков в кишечнике. Вырабатывается в виде неактивного химотрипсиногена … Большой Энциклопедический словарь
Протеолитич. фермент большинства позвоночных, участвующий вместе с трипсином и др. пептидазами в расщеплении белков в тонком кишечнике; синтезируется клетками поджелудочной железы в форме неактивного предшественника химотрипсиногена и… … Биологический энциклопедический словарь
Сущ., кол во синонимов: 1 фермент (253) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов
химотрипсин - Протеолитический фермент позвоночных, синтезируется в поджелудочной железе в форме предшественника химотрипсиногена. [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский толковый словарь генетических терминов 1995 407с.] Тематики генетика EN chymotripsin … Справочник технического переводчика
Пищеварительный фермент сока поджелудочной железы; участвует в расщеплении белков в кишечнике. Вырабатывается в виде неактивного химотрипсиногена. * * * ХИМОТРИПСИН ХИМОТРИПСИН, пищеварительный фермент сока поджелудочной железы; участвует в… … Энциклопедический словарь
- (гр.chymoscok + трипсин) фермент, расщепляющий белки пищи; вырабатывается клетками поджелудочной железы. Новый словарь иностранных слов. by EdwART, 2009. химотрипсин а, мн. нет, м. (… Словарь иностранных слов русского языка
Chymotripsin химотрипсин [КФ 3.4.21.1 2]. Протеолитический фермент позвоночных, синтезируется в поджелудочной железе в форме предшественника химотрипсиногена. (
Эндопептидаза, гидролизующий пептиды и белки.
Химотрипсин (КФ 3.4.21.1) синтезируется в поджелудочной железе в виде проферментов химотрипсиногена А и химотрипсиногена В и, в таком виде, в составе панкреатического сока попадает в двенадцатиперстную кишку , где, под воздействием трипсина химотрипсиногены превращаются в α-, β- и π-химотрипсины.
Химотрипсин преимущественно расщепляет связи, образованные СООН-группами аминокислот, имеющими гидрофобные боковые цепи, и отличается более широкой специфичностью действия, чем трипсин. Химотрипсин, например, в отличие от трипсина, створаживает молоко.
Химотрипсин наиболее активен при рН от 7,5 до 8,2.
Исследование производят спустя три дня после отмены всех пероральных ферментных препаратов. Предпочтительным является взятие небольшого количества (1 г) из суточного объема кала. Принцип метода основан на расщеплении химотрипсином М-ацетил-тирозин-этилового эфира с образованием кислых продуктов, которые оттитровывают щелочью. При выраженных нарушениях экзокринной функции поджелудочной железы тест обнаруживает значительное снижение содержания химотрипсина. Вместе с тем, при умеренных функциональных нарушениях отмечается довольно значительное количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов. В связи с этим определение химотрипсина кала признается большинством авторов ориентировочным тестом выявления выраженных экзокринных нарушений функции поджелудочной железы различной природы (Саблин О.А. и др.).
Профессиональные медицинские публикации, затрагивающие роль химотрипсина в гастроэнтерологии
- Саблин О.А., Гриневич В.Б., Успенский Ю.П., Ратников В.А. Методы исследования экзокринной функции // В кн. Функциональная диагностика в гастроэнтерологии. СПб, 2002.
- Калинин А.В. Нарушение полостного пищеварения и его медикаментозная коррекция // Клинические перспективы в гастроэнтерологии, гепатологии. – 2001. – №3. – с. 21–25 .
- Саблин О.А., Бутенко Е.В. Ферментные препараты в гастроэнтерологии // Consilium-Medicum. – 2004. – Том 6. – № 1. Гастроэнтерология.
Химотрипсин - лекарственное средство
Химотрипсин - международное непатентованное наименование (МНН) лекарственного средства, по АТХ он включён в группы:- «B06 Прочие гематологические препараты », где ему присвоен код «B06AA04 Химотрипсин»
- «S01 Препараты для лечения заболеваний глаз », код «S01KX01 Химотрипсин»
Сериновые протеиназы.
Механизм действия химотрипсина и карбоксипептидазы.
Ранее уже упоминалось, что поджелудочная железа ответственна за продукцию целой группы протеолитических ферментов, гидролизующих пептидные связи, образованные разными аминокислотами. Ферменты, участвующие в переваривании белков, и их специфичность в отношении пептидных связей, образуемых разными аминокислотами, приведены в табл. 3.1. Наиболее важным и полно изученным представителем интестинальных протеиназ, относящихся к семейству сериновых протеиназ , является химотрипсин. Химотрипсин представляет собой пищеварительный фермент, синтезируемый в виде зимогена ацинарными клетками поджелудочной железы.
Таблица 3.1
Субстратная специфичность протеиназ желудочно-кишечного тракта
Активный фермент |
Зимоген |
Активатор |
Расщепляемая |
|
пептидная связь |
||||
Карбоксипротеиназы |
Автоактивация, |
|||
Пепсин А |
Пепсиноген А |
активный пепсин |
||
Сериновые |
||||
протеиназы |
||||
Трипсин |
Трипсиноген |
Энтерокиназа, |
||
Трипсин |
||||
Химотрипсин |
Химотрипсиноген |
Трипсин |
Tyr, Phe, Trp, Met |
|
Эластаза |
Проэластаза |
Трипсин |
||
пептидазы |
||||
Карбоксипептидаза А |
Прокарбоксипепти- |
Val, Leu, Ile, Ala с |
||
Карбоксипептидаза В |
Прокарбоксипепти- |
|||
Аминопептидаза |
Проаминопепти- |
Отщепление N- |
||
концевых |
||||
остатков (за |
||||
исключением Pro) |
||||
Внутри ацинарных клеток новосинтезированные молекулы белка транспортируются из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, где они окружаются белково-липидной мембраной – так образуются зимогеновые гранулы, которые в электронном микроскопе выглядят как очень плотные тельца (рис. 3.3).
Рис. 3.3 Электронная микрофотография зимогеновых гранул в ацинарных клетках поджелудочной железы (по рисунку G. Palade из Страйер Л ., Биохимия
«Мир», М., т. 2, 1985).
Зимогеновые гранулы, содержащие химотрипсиноген, накапливаются в верхушке ацинарных клеток и затем под действием гормонального или нейронального сигнала выбрасываются в проток, ведущий в двенадцатиперстную кишку.
Химотрипсиноген представлен одной полипептидной цепью из 245 аминокислот. Цепь стабилизирована пятью дисульфидными мостиками. Активация химотрипсиногена осуществляется под действием трипсина, расщепляющего пептидную связь между аргинином-15 и изолейцином-16.
Образующийся при этом активный π -химотрипсин действует на другие молекулы химотрипсиногена (рис. 3.4).
Рис. 3.4 Схема, иллюстрирующая последовательность стадий активации химотрипсина
Далее π -химотрипсин подвергается дополнительному протеолитическому действию химотрипсина с выщеплением двух дипептидов Ser14 -Arg15 и Thr147 -Asn148 и образованием стабильной формы фермента – α - химотрипсина.
Поскольку химотрипсин является одним из наиболее полно изученных ферментов, целесообразно рассмотреть его структуру и механизм действия более детально. Молекула α -химотрипсина состоит из трех полипептидных цепей, соединенных двумя межцепочечными дисульфидными связями (рис. 3.5).
Рис. 3.5 Молекула α -химотрипсина имеет два межцепочечных дисульфидных мостика и три внутрицепочечные дисульфидные связи.
Молекулярная масса α -химотрипсина составляет около 25.000 Да. Молекула имеет компактную эллипсоидную форму размером 51× 40× 40 Å. Все заряженные группы, за исключением трех, необходимых для катализа, находятся на поверхности молекулы.
Равновесие реакции гидролиза сдвинуто практически полностью в сторону расщепления пептидных связей. Однако химотрипсин способен гидролизовать с высокой скоростью далеко не каждую пептидную связь. Он действует избирательно на связи, образованные карбоксильными группами ароматических кислот и аминокислот с гидрофобными радикалами большого размера, например метионина .
Характерной особенностью химотрипсина является его способность гидролизовать эфирные связи . По существу, значительная часть сведений о механизме действия химотрипсина была получена при изучении гидролиза
сложных эфиров.
Как было показано, химотрипсин катализирует гидролиз пептидных и эфирных связей в два отдельных этапа. Впервые это было обнаружено при изучении кинетики гидролиза сложноэфирной связи n -нитрофенилацетата.
Анализ реакции показал, что высвобождение в ходе гидролиза одного из продуктов – n -нитрофенола происходит в две стадии: сначала n - нитрофенол высвобождается взрывообразно , а затем он образуется уже с
меньшей стационарной скоростью.
В общих чертах процесс гидролиза n -нитрофенилацетата сводится к образованию фермент-субстратного комплекса, затем эфирная связь в субстрате расщепляется и n -нитрофенол высвобождается, при этом ацетильная группа субстрата остается ковалентно связанной в активном центре фермента. Далее вода атакует ацетил-ферментный комплекс с образованием ацетат-иона и регенерированного фермента (рис. 3.6)
Рис. 3.6 Ацилирование: образование комплекса ацетил-фермент в качестве промежуточного продукта. Деацилирование: гидролиз промежуточного комплекса ацетил-фермент.
Быстрая начальная фаза высвобождения n -нитрофенола связана с образованием ацил-ферментного комплекса, показанного на рис. 3.6 значком
(*). Этот этап называют ацилированием . Второй этап, называемый деацилированием , соответствует стационарной стадии реакции, являющейся одновременно лимитирующей . Ацил-ферментный комплекс оказался настолько стабильным, что в определенных условиях, его удается выделить. После того, как при pH 3 был выделен в чистом виде этот промежуточный ацил-ферментный комплекс, удалось охарактеризовать место, по которому происходит присоединение ацильной группы к ферменту. Оказалось, что ацильная группа связана с атомом кислорода специфического остатка серина
– серина-195 (Ser-195). Именно по этой причине химотрипсин относят к группе сериновых протеиназ . Этот остаток серина проявляет необычайно высокую реакционную способность. Его можно специфически пометить
органическим фторфосфатом – диизопропилфторфосфатом (рис. 3.7).
Рис. 3.7 Диизопропилфосфат (ДПФФ) инактивирует химотрипсин путем образования диизопропилфосфорильного производного серина-195.
О повышенной реакционной способности серина-195 говорит тот факт, что остальные 27 остатков серина в химотрипсине абсолютно не взаимодействуют с диизопропилфторфосфатом (ДПФФ). Кстати, химотрипсин не единственный фермент, который ингибируется ДПФФ. Многие другие протеолитические ферменты такие, как трипсин, эластаза,
тромбин, бактериальный субтилизин также специфически реагируют с ДПФФ, полностью теряя при этом активность. Как и в случае химотрипсина, данные протеиназы взаимодействуют с ДПФФ за счет одного единственного остатка серина. Таким образом, уместно говорить о существовании целого семейства сериновых протеиназ.
В каталитических актах химотрипсина, однако, принимает участие не только боковой радикал Ser-195. Было показано, что в активном центре фермента важную роль играет также остаток гистидина – His-57. Доказать его участие в катализе удалось с помощью так называемой аффинной метки , которая связывается с химотрипсином подобно субстрату с одной стороны и образует ковалентную связь с определенной группой в активном центре, с другой стороны.
Такой меткой для химотрипсина является соединение тозил-L- фенилаланинхлорметилкетон , строение которого приведено на рис. 3.8.
Рис. 3.8 Структура тозил-L-фенилаланинхлорметилкетона, используемого в качестве аффинной метки химотрипсина (R – тозильная группа).
Наличие в молекуле метки боковой цепи, представленной фенилаланином, обеспечивает ее специфическое взаимодействие с ферментом. Реакционноспособная группа метки – хлорметилкетон взаимодействует только с остатком His-57 и алкилирует один из атомов азота гистидинового кольца. Взаимодействие такой аффинной метки с химотрипсином полностью лишает его ферментативной активности. Существует несколько доказательств высокой специфичности взаимодействия метки с химотрипсином:
− во-первых, аффинная метка высоко стереоспецифична. D-изомер метки с химотрипсином не взаимодействует;
− во-вторых, конкурентный ингибитор химртрипсина – β -фенилпропионат тормозит процесс взаимодействия метки с белком;
− в-третьих, скорость инактивации химотрипсина при добавлении метки находится в такой же зависимости от pH, как скорость катализа.
Схема взаимодействия тозил-L-фенилаланинхлорметилкетона с His-57 приведена на рис. 3.9.
Рис. 3.9 Алкилирование гистидина-57 в химотрипсине при взаимодействии с тозил-L-фенилаланинхлорметилкетоном.
Таким образом, для проявления каталитической активности химотрипсина принципиальным является присутствие в активном центре фермента остатков Ser-195 и His-57. Как было показано позже, рядом с этими остатками в молекуле химотрипсина находится также остаток аспарагиновой кислоты - Asp-102. Рентгеноструктурный анализ показал, что все три остатка находятся рядом друг с другом и создают так называемую систему переноса заряда за счет того, что Asp-102 образует водородную связь с His-57, который в свою очередь соединен водородной связью с Ser195 (рис. 3.10).
Рис. 3.10 Система переноса заряда в активном центре химотрипсина в отсутствие субстрата (Blow D.M., Steitz T.A., X-ray diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39 , 86-95).
Карбоксилат-ион Asp-102 поляризует имидазольную группу His-57, что повышает его способность осуществлять челночное связывание протона, и при взаимодействии субстрата с молекулой химотрипсина Asp-102 и His-57 акцептируют протон гидроксильной группы Ser-195.
Рис. 3.11 Система переноса заряда в активном центре химотрипсина в присутствии субстрата. При добавлении субстрата происходит промежуточное связывание протона аспартатом-102 и гистидином-57 (Blow D.M., Steitz T.A., X-ray diffraction studies of enzymes, Ann. Rev. Biochem., 1976, 39 , 86-95).
Локализация сайтов специфического связывания субстрата и вероятная ориентация гидролизуемой пептидной связи были установлены в результате выполнения рентгеноструктурного анализа комплексов химотрипсина с аналогами субстрата. В частности было показано на примере изучения комплексов химотрипсина с негидролизуемым аналогом субстрата – формил-L-триптофаном существование в ферменте глубокого гидрофобного
кармана вблизи серина-195, который по размеру соответствует боковым радикалам ароматических аминокислот (рис. 3. 12).
Рис. 3.12 Схематическое изображение связывания формил-L-триптофана химотрипсином.
Именно наличием этого глубокого кармана объясняется специфичность химотрипсина в отношении аминокислот с ароматической или иной гидрофобной боковой цепью большого размера. При рентгеноструктурном анализе комплексов химотрипсина с аналогами полипептидных субстратов обнаружено большое число водородных связей между основными цепями фермента и субстрата, которые располагаются также, как в антипараллельных β -складчатых слоях.
Механизм каталитического действия химотрипсина
Интенсивные и всеобъемлющие рентгеноструктурные и биохимические исследования химотрипсина позволили прийти к определенному выводу относительно механизма его каталитического действия. Как уже упоминалось, His-57 и Ser-195 принимают непосредственное участие в расщеплении пептидной связи субстрата. Гидролиз этой связи начинается с того, что кислородный атом OH-группы Ser-195 атакует атом углерода карбонильной группы
гидролизуемой пептидной связи субстрата. В результате связь между атомами C и O в карбонильной группе становится одинарной и атом O приобретает отрицательный заряд. При этом четыре разных атома, связанные с углеродом карбонильной группы располагаются в виде тетраэдра. Образование такого тетраэдрического промежуточного соединения оказывается возможным благодаря возникновению водородных связей между отрицательно заряженным атомом кислорода (называемым оксианионом ) и двумя NH-группами основной цепи фермента (рис. 3.13).
Рис. 3.13 Тетраэдрическое промежуточное соединение в реакциях ацилирования и деацилирования химотрипсина. Стабильность промежуточного соединения обеспечивают водородные связи, образованные NHгруппами основной цепи фермента.
Этот участок химотрипсина называется полостью оксианиона . В механизме образования упомянутого промежуточного соединения важнейшую роль играет перенос протона от Ser-195 на His-57.
Рис. 3.14 Первый этап гидролиза пептидов химотрипсином – ацилирование. Образуется тетраэдрическое промежуточное соединение. Затем аминный компонент субстрата быстро отделяется от фермента, а сам фермент превращается в промежуточный продукт – ацил-фермент.
Перенос протона значительно облегчается благодаря присутствию системы переноса заряда. Остаток Asp-102 строго ориентирует положение имидазола гистидина-57 и частично нейтрализует заряд появляющийся на этом кольце. Протон, связанный парой His-Asp переходит затем к атому азота гидролизуемой пептидной связи, которая в результате разрывается. На этой стадии аминный компонент субстрата соединяется водородной связью с His-57, а кислотный компонент – эфирной (ковалентной) связью с Ser-195, завершая тем самым этап ацилирования . Таким образом, при ацилировании химотрипсина образуется промежуточное тетраэдрическое соединение (1) и, в последствии, аминный компонент субстрата (2) быстро отделяется от фермента. Сам фермент превращается в промежуточный продукт катализа – ацил-фермент (3) (рис. 3.14).
Рис. 3.15 Второй этап гидролиза пептидов химотрипсином – деацилирование. Ацил-фермент гидролизуется водой. Деацилирование по существу представляет собой реакцию, обратную ацилированию, но место аминного компонента субстрата занимает вода.
На следующей стадии – деацилирования аминный компонент диффундирует от фермента, а его место в активном центре занимает вода.
По сути дела деацилирование представляет собой процесс обратный ацилированию. Сначала система переноса заряда отрывает протон от воды.
