Извлеченным из организма клеткам можно создать такие условия, при которых они будут жить и размножаться в искусственной среде (in vitro - вне организма, в отличие от in vivo - в организме), образуя культуру клеток. Клеточные культуры можно получать из таких клеток, которые в составе организма потеряли способность к делению, например из лейкоцитов периферической крови. Изучение поведения клеток в культуре помогает понять механизмы контроля деления клеток. Установлено, что в этом контроле главную роль играют клеточные взаимодействия. Наблюдение за клеточными культурами показало, что клетки активно делятся и расползаются по стеклу сосуда, в котором их культивируют до тех пор, пока они не начнут соприкасаться друг с другом. Контакт поверхностей соседних клеток приводит к остановке их движения и одновременно выключает клетки из размножения. Когда клетки плотным слоем покроют всю доступную им поверхность сосуда, деления прекратятся. Некоторое время клетки будут жить, потом в них начнут возникать всевозможные нарушения, и если часть клеток не пересадить в другой сосуд, на новую среду, то культура погибнет. Интересно, что пересев клеток на новую среду не всегда стимулирует клеточное размножение. Клетки, претерпевшие несколько пересевов, со временем не приступают к делению даже на новой среде. Специальные эксперименты показали, что клетки, взятые из тканей взрослых организмов, способны делиться in vitro меньшее число раз, чем клетки, полученные из эмбрионов. Причину этого явления, названного по имени открывшего его ученого феноменом Хейфлика , многие исследователи видят в старении клеток, и в настоящее время клеточные культуры служат объектом изучения механизмов старения на клеточном уровне. Клетки, взятые из раковых опухолей, ведут себя в культуре немного иначе. Контакт поверхностей клеток не останавливает их делений, они продолжают размножаться и культура становится многослойной. Не подчиняются опухолевые клетки и правилу Хейфлика: они могут претерпевать неограниченное число делений. Некоторые клетки в культуре остаются дифференцированными: синтезируют специфические белки, сохраняют морфологические особенности, например опухолевые клетки лимфоидного происхождения. Другие клетки при переносе их в искусственные условия становятся недифференцированными. Изменение условий выращивания иногда приводит к потере, иногда к приобретению свойств дифференцированных клеток. Это позволяет использовать клетки в культуре для изучения механизмов клеточной дифференцировки. Сохранение некоторыми клетками in vitro дифференцированного состояния послужило толчком для создания клеточных культур с практическими целями для получения из них веществ, которые синтезируются этими клетками. Так получают антитела к различным белкам. Можно получать и лекарственные вещества из клеток тех растений, которые плохо выращиваются на плантациях. Клеточные культуры нашли применение и в медицине. Для диагностики наследственных заболеваний иногда необходимо достаточно большое количество клеток организма для того, чтобы можно было провести биохимический анализ. Если диагноз нужно установить у эмбриона человека, то взятие материала на анализ представляет большую проблему. В этом случае на помощь приходит техника клеточных культур: несколько сотен клеток, взятых из ворсинок оболочки зародыша без вреда для него, достаточно, чтобы вырастить большую клеточную массу. Клеточные культуры используют и в вирусологии - для выращивания вирусов и изучения их свойств, а также в фармацевтической и химической промышленностях для исследования повреждающего действия на ДНК и хромосомы вновь синтезированных химических веществ.

Возможно поддержание жизни тканей и органов вне организма путем выращивания их в культуре. Впервые попытки поддержания жизнедеятельности клеток человека и животных в лабораторных условиях были предприняты в 1907 г. Харрионом и в 1912 г. Каррелем. Однако лишь в 1942 г. Ж. Моно предложил современные методы культивирования in vitro.

Культура клеток представляет собой популяцию генотипически однотипных клеток, которые функционируют и делятся in vitro. Культуры клеток, полученные путем целенаправленных или случайных мутаций, называются клеточными линиями .

Рост клеточных культур in vitro имеет сложный характер. В целом выделяют следующие фазы:

1. Индукционный период (лаг-фаза). В течение лаг-фазы не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования продуктов. Данная фаза обычно наблюдается после пересева клеточной культуры. В ней происходит адаптация клеток к новой культуральной среде, перестраивается метаболизм клетки.

2. Фаза экспоненциального роста. Она характеризуется быстрым накоплением биомассы и продуктов жизнедеятельности клеточных культур. В данной фазе наиболее часто встречаются митозы по сравнению с остальными фазами роста. Но в этой фазе экспоненциальный рост не может продолжаться бесконечно долго. Она переходит в следующую фазу.

Рис. 4.2. Клеточная культура Нер-2, 48 часов культивирования, видны митозы.

3. Фаза линейного роста. Характеризуется уменьшением числа митозов

4. Фаза замедленного роста. В этой фазе уменьшается рост клеточной культуры за счет уменьшения числа митозов.

5. Стационарная фаза . Наблюдается вслед за фазой замедления роста, при этом число клеток практически не меняется. В этой фазе либо происходит прекращение митотического деления клеток, либо число делящихся клеток равно числу отмирающих клеок.

6. Фаза отмирания культуры, в которой преобладают процессы гибели клеток и практически не наблюдаются митотические деления.

Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 6 наблюдаются в значительной степени за счет истощения субстратов, необходимых для роста популяции клеток, или же за счет накопления токсичных продуктов их жизнедеятельности. Субстраты, ограничивающие рост клеточных культур получили название лимитирующих .

В условиях, когда концентрация субстратов и других компонентов, необходимых для роста клеток постоянна, процесс увеличения числа клеток носит автокаталитический характер. Данный процесс описывается следующим дифференциальным уравнением:

где N – число клеток, μ – удельная скорость роста.

Рис. 4.3. Клеточная культура RD – рабдомиосаркома человека. Монослой, живые неокрашенные клетки.

Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 6 наблюдаются в значительной степени за счет истощения субстратов, необходимых для роста популяции клеток, или же за счет накопления токсических продуктов их жизнедеятельности.

Для поддержания жизни клеток в культуре необходимо соблюдать ряд обязательных условий:

Необходима сбалансированная питательная среда;

Строжайшая стерильность;

Оптимальная температура;

Своевременный пассаж, т. е. пересев на новую питательную среду.

Впервые на лимитирование процессов роста культур клеток субстратами ферментативных реакций обратил внимание Ж. Моно. Субстраты, ограничивающие рост клеточных популяций, получили название лимитирующих.

Практически для всех клеточных популяций характерно изменение скорости роста под действием ингибиторов и активаторов. Выделяют ингибиторы, действующие на ДНК (налидиксоновая кислота), ингибиторы, действующие на РНК (актиномицин Д), ингибиторы синтеза белка (левомицетин, эритромицин, тетрациклин), ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллин), мембраноактивные вещества (толуол, хлороформ), ингибиторы энергетических процессов (2,4 – динитрофенол), ингибиторы лимитирующего фермента.

Одним из важнейших факторов, определяющих кинетику клеточного роста, являются ионы водорода. Многие клеточные культуры растут в узком диапазоне рН; изменение рН приводит к замедлению их скорости роста или к полному прекращению роста

Одна из первых попыток описать феномен ограничения роста популяций была предпринята П. Ферхгюльстом в 1838 г. Он предположил, что помимо процесса размножения организмов, есть процесс гибели организмов, наблюдаемых из-за «тесноты», т.е. данный процесс происходит при встрече двух индивидов.

В развитии любой клеточной популяции наступает период остановки клеточного роста и гибели клеток. Очевидно, что остановка роста и гибель клеток имеют не меньшее значение, чем их размножение и рост. Особенно эти процессы важны для многоклеточных организмов. Неудержимый и неконтролируемый рост отдельных клеток – причина онкологических заболеваний, остановка роста, старение и гибель клеток – причина старения и смерти организма в целом.

Различные популяции и различные клетки ведут себя совершенно по- разному. Бактериальные клетки и клетки одноклеточных организмов внешне представляются «бессмертными». При попадании в подходящую комфортную среду с избытком лимитирующего субстрата клетки начинают активно размножаться. Ограничение их роста определяется расходом субстрата, накоплением продуктов-ингибиторов, а также специфическим механизмом ограничения роста, который называется «прогрессирующей некомпетентностью».

Клетки многоклеточных организмов ведут себя совершенно по-другому. Дифференцированные клетки составляют органы и ткани, и их рост и размножение принципиально ограничены. Если механизм контроля роста разрушается, возникают индивидуальные клетки, растущие неограниченно. Эти клетки составляют популяцию раковых клеток, их рост приводит к гибели организма в целом.

Исследования проблемы старения «нормальных» клеток многоклеточных организмов имеет весьма интересную историю. Впервые мысль о том, что нормальные соматические клетки животных и человека детерминированно должны терять способность к делению и гибнуть, была высказана великим немецким биологом Августом Вейсманом в 1881 г. Приблизительно в это же время ученые научились переводить клетки животных и человека в культуру. В начале века известный хирург, один из основателей техники культивирования клеток in vitro, лауреат Нобелевской премии Алексис Каррель поставил эксперимент, который продолжался 34 года. В течение этого срока он культивировал клетки фибробластов, полученные из сердца цыпленка. Опыт был остановлен, потому что автор был уверен, что клетки можно культивировать вечно. Эти результаты убедительно демонстрировали, что старение не является отражением процессов, происходящих на клеточном уровне.

Однако этот вывод оказался ошибочным. «Бессмертными» являются перерожденные (трансформированные) клетки, потерявшие контроль роста и превратившиеся в раковые. Лишь в 1961 г.Л. Хейфлик, вернувшись к опытам А. Карреля, показал, что нормальные «не трансформированные» фибробласты человека способны провести около 50 делений и полностью прекратить размножение. В настоящее время нет сомнений, что нормальные соматические клетки обладают ограниченным репликационным потенциалом.

Для определения совокупности процессов «программированного» старения и гибели клеток был предложен термин «апоптоз». Апоптоз следует отличать от некроза – гибели клеток за счет случайных событий или под действием внешних токсинов. Некроз приводит к попаданию содержимого клетки в окружающую среду и в норме вызывает воспалительную реакцию. Апоптоз – это фрагментация содержимого клетки изнутри, осуществляемая специальными внутриклеточными ферментами, индукция и активация которых происходит при получении клеткой внешнего сигнала или при принудительной инъекции в клетку ферментов – активаторов апоптозной «машины», или при повреждении клетки внешними факторами, не приводящими к некрозу, но способными инициировать апоптоз (ионизирующая радиация, обратимый перегрев и др.).

Современный интерес исследователей к апоптозу очень велик, он определяется осознанием важной роли апоптоза в поведении клеточных популяций, т.к. его роль не меньше, чем роль процессов роста и размножения клеток.

Концепция «программируемой» клеточной смерти существовала очень долго, однако лишь в 1972 г. после работы Керра, Вилли и Куррье, в которой было показано, что многие процессы «программируемой» и «непрограммируемой» клеточной гибели совершенно близки, интерес к апоптозу сильно возрос. После того, как была показана роль в апоптозе процессов деградации ДНК и во многих случаях необходимый синтез de novo РНК и специфических белков, апоптоз стал предметом биохимии и молекулярной биологии.

Молекулярная биология апоптоза весьма разнообразна. Апоптоз изучают по морфологическим изменениям клеток, по индукции, активности и появлению продуктов трансглутаминазы, «сшивающей» белки, по фрагментации ДНК, по изменению потоков кальция, по появлению на мембране фосфатидилсерина.

В 1982 г. С.Р. Уманский предположил, что одной из функций программы клеточной гибели эукариотических клеток является элиминация постоянно возникающих клеток с онкогенными свойствами. Подтверждением этой гипотезы является открытие белка р53 – индуктора апоптоза и опухолевого супрессора. Белок р53 является регулятором транскрипции, способным узнавать специфические последовательности ДНК. Ген р53 активирует несколько генов, задерживающих деление клетки в G 1 -фазе. После действия факторов, повреждающих ДНК (радиация, УФО) экспрессия гена р53 в клетках существенно усиливается. Под влиянием р53 клетки, имеющие множественные разрывы ДНК, задерживаются в фазе G 1 , а если входят в S-фазу (например, в случае трансформации опухолей), то подвергаются апоптозу.

Мутация гена р53 позволяет клеткам с поврежденной ДНК завершить митоз, сохраняет клетки, подвергшиеся опухолевой трансформации, при этом они оказываются резистентными к лучевой и химиотерапии. Мутантная форма белка р53 не обладает способностью останавливать клеточный цикл.

Наиболее распространенная в настоящее время концепция «программируемого» старения основана на представлении о теломере. Дело в том, что ДНК-полимераза не способна реплицировать «хвосты» 3 / - конца матрицы ДНК – несколько нуклеотидов на 3 / - конце. Многократная репликация ДНК в процессе размножения клеток в этом случае должна приводить к укорачиванию считываемой области. Это укорочение и может быть причиной старения и падения репликационного потенциала, ухудшения функционирования хромосом. Для предотвращения этого процесса специфический фермент теломераза синтезирует на концах ядерной ДНК многократно повторяемый гексануклеотид TTAGGG, образующий протяженный участок ДНК, называемый теломерой. Фермент теломераза был предсказан в 1971 г. А. Оловниковым и открыт в 1985 г. Грейдером и Блэкберном.

В большинстве клеток нормальных тканей человека теломераза неактивна, и поэтому клетки подвергаются апоптозу через 50 – 100 делений, считая от их образования из клетки-предшественницы. В клетках злокачественных опухолей ген теломеразы активен. Поэтому, несмотря на свою «старость» по количеству пройденных клеточных циклов и накопление большого количества мутационных изменений в структуре ДНК, продолжительность жизни злокачественных клеток почти не ограничена. Для преодоления укорачивания генома и старения согласно этим представлениям клетка должна активировать теломеразный ген и экспрессировать большее количество теломеразы.

Рост клеточных популяций ограничен рядом факторов, приводящих к существованию предела в накоплении клеточной биомассы. Для клеток животных и растений ограничение роста является жизненной необходимостью, т.е. рост многоклеточных организмов ограничен. К наиболее важным факторам, ограничивающих рост клеточных популяций относятся:

1. Истощение системы по лимитирующему субстрату;

2. Появление в популяции клеток, потерявших способность к делению.

3. Накопление продуктов, являющихся сильными ингибиторами роста.

Ограничение роста клеточной популяции может иметь специфический характер запрограммированного отказа. Биохимические механизмы, останавливающие пролиферацию клеток, имеют, по-видимому, различную природу. В настоящее время ясно, что в ряде случаев остановка роста связана с потерей чувствительности клеток к ростовым факторам среды. В качестве примера можно привести особенности роста популяции лимфоцитов, индуцированного действием ростовых факторов. Например, динамика появления и исчезновения на клеточной мембране Т-лимфоцитов рецептора к фактору роста характеризуется тем, что быстрая экспрессия рецептора сменяется стадией его потери. Возможно, что «десенситизация» рецептора к ростовому фактору связана с механизмом его инактивации в процессе реакции.

Для получения культуры лучше всего использовать свежие клетки, взятые из тканей взрослого человека, эмбриона и даже из злокачественных опухолей. В настоящее время получены культуры клеток легкого, кожи, почки, сердца, печени и щитовидной железы. Клетки выращивают на твердых или жидких питательных средах в виде монослойной культуры, например на стекле, или в виде суспензии во флаконах или специальных приборах - ферментерах.

В настоящее время для изучения механизмов, лежащих в основе роста и развития клеточных популяций все шире применяются методы математического моделирования с использованием вычислительной техники. С одной стороны, эти подходы обеспечивают возможность фундаментального исследования динамики процессов с учетом всей совокупности эффектов, усложняющих рост популяции, с другой – позволяют вести обоснованный поиск технологических режимов, тонкого управления процессом роста клеток.

Продолжительность жизни некоторых штаммов клеток в культуре может достигать более 25 лет. Однако по данным Hayflick (1965) продолжительность жизни клеток в культуре не превосходит продолжительность жизни того вида организма, от которого они взяты. При большой продолжительности содержания клеток в культуре они могут перерождаться в раковые. Так, например, старение диплоидных фибробластов человека в культуре тканей соответствует старению целого организма. Легче поддерживать культуру клеток мало дифференцированных или недифференцированных тканей - клеток лимфоцитов, фибробластов, некоторых эпителиальных клеток. Плохо растут на питательных средах высокодифференцированные и узко специализированные клетки внутренних органов (печени, миокарда и др.).

Метод культуры тканей имеет большое значение для изучения злокачественных опухолей и их диагностики, изучения закономерностей регенерации (пролиферации, факторов регенерации и т. д.), для получения чистого продукта деятельности клеток (ферментов, гормонов, лекарственных препаратов), для диагностики наследственных заболеваний. Культура клеток широко используется в генетической инженерии (выделение и перенос генов, картирование генов, получение моноклональных антител и т.д.). На клеточных культурах изучается мутагенность и канцерогенность различных химических и биологических соединений, лекарственных препаратов и др.

В настоящее время невозможно представить выделение и исследование вирусов без применения клеточных культур. Первое сообщение о размножении вируса полиомиелита на клеточных культурах появилось в 1949 г. (Enders J.F. et al.). Клеточные культуры в вирусологии применяются для следующих целей: 1) выделения и идентификации вирусов; 2) обнаружения вирусной инфекции по значительному увеличению количества антител в парных сыворотках; 3) приготовления антигенов и антител для использования в серологических тестах. Основными источниками тканей для получения однослойных культур служат ткани животных, например, почки обезьян, злокачественные опухоли человека, ткани зародыша человека.

Важную роль в исследованиях макрофагальной системы также играет метод искусственного культивирования. Исследуется роль этой системы в инфекционном процессе, в образовании антител, метаболизме пигментов крови, в нарушениях липидного обмена, в метаболизме химиотерапевтических препаратов, биохимические и биофизические свойства, а также неопластические потенции этих клеток. Большая часть этих исследований обобщена в монографии Нельсона (Nelson D.S., 1969). В чистой культуре макрофаги впервые выделили в 1921 г. Каррел и Эбелинг из крови курицы. Поскольку многие работы, выполненные на макрофагах, имеют отношение к проблемам физиологии и патологии человека, желательно проводить такие исследования на культурах макрофагов человека или млекопитающих, хотя макрофаги млекопитающих не размножаются на искусственной питательной среде. Доступным источником макрофагов может служить кровь, но выход макрофагов мал. Наиболее широко используемым источником макрофагов является перитонеальная жидкость. Она содержит много макрофагов и обычно свободна от других клеток. Много свободных макрофагов присутствует в легких (альвеолярные макрофаги). Их получают путем смывов из альвеол и воздухоносных путей кролика.

Анализ кариотипа человека невозможен без применения культуры клеток. С этой целью исследуют лимфоциты крови, селезенки, лимфоузлов, клетки костного мозга, фибробласты человека и клетки амниотической жидкости. Для стимуляции митозов лимфоцитов в культуральную среду добавляют фитогемагглютинин. Рост клеток длится 48 – 72 часа. За 4 – 6 часов до конца культивирования в среду добавляют колхицин, который останавливает делящиеся клетки в метафазе, т.к. подавляет образование веретена деления. Для того, чтобы получить хороший разброс хромосом на метафазных пластинках, клетки обрабатывают гипотоническим раствором (0,17%) хлорида натрия или другими растворами.

Для диагностики многих биохимических и цитогенетических дефектов зародыша в последние годы широко используется культура клеток зародыша, полученная при трансабдоминальном амниоцентезе. Амниоцентез проводят между 15 – 18 нед. беременности. Клеточная популяция амниотической жидкости в этот период состоит главным образом из слущенных клеток эктодермального происхождения: из клеток амниона, эпидермиса кожи, а также эпителия потовых и сальных желез, ротовой полости и частично пищеварительного тракта и моче - половых путей и других частей зародыша. В 1956 г. появились сообщения об определении хромосомного пола плода на основании исследования полового хроматина в клетках амниотической жидкости. В 1963 г. Фукс и Филип получили культуру клеток амниотической жидкости. В настоящее время используют несколько методов получения культур клеток амниотической жидкости. Обычно для анализа берут 10 мл пробы жидкости, центрифугируют, осадок клеток ресуспендируют и высевают в пластиковые флаконы или чашки Петри в специальную среду. Рост становится заметным через несколько дней. После пересева суспензию клеток на 14 – 21 сутки используют для получения метафазных пластинок.

Большая часть современных знаний по молекулярной биологии, молекулярной генетике, генетической инженерии была получена на основе изучения клеточных культур микроорганизмов. Это определяется тем, что микроорганизмы и клеточные линии относительно легко культивируются, процесс генерации нового поколения занимает от десятков минут до нескольких часов по сравнению с макроорганизмами, для роста которых требуются годы и десятилетия. Вместе с тем сценарии развития близки для всех популяций, развивающихся в закрытых системах.

Клеточная культура

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.

История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор , содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней . Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток.

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс . Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей. Клетки, взятые непосредственно от объекта, называются первичными . Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки подвергаются процессу старения и прекращают делиться, но жизнеспособность не утрачивают. Существуют «бессмертные» линии клеток, способные размножаться бесконечно. Эта способность является результатом случайной мутации , либо приобретена искусственно, с помощью подавления гена теломеразы .

Выращивание клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре и в специальной газовой среде в инкубаторе клеточных культур . Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др . Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего получают из крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование зараженных ингридиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Клетки можно выращивать в суспензии , либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно измененных таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности, это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения сцепных свойств, и для стимулирования роста и дифференцирования. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяется органотипический тип культуры клеток, который представляет собой трехмерную среду, в отличие от от обычной лабораторной посуды. Этот система культивирования физически и биохимически наиболее схожа с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии).

Перекрестное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами ученые могут столкнуться с проблемой перекрестного загрязнения. Судя по результатам исследований, можно предположить, что в 15-20 % случаев клетки, используемые в экспериментах были испорчены, или были загрязнены клетками других клеточных линий .

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего могут возникнуть следующие проблемы:

• Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
• Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
• Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
• По той же причине может начаться клеточное дифференцирование .

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассажирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин , стрептомицин) и противогрибковые препараты(амфотерицин Б).

Линии клеток человека

Одна из самых ранних культур клеток человека, полученная от Генриетты Лакс, которая умерла от рака шейки матки. Культура клеток ядра окрашены в синий цвет.

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики , поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета », согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удаленных с их согласия .

Линия клеток «Гибридома»

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты , синтетические гормоны , моноклональные антитела , интерлейкины , лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин . Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений .

Тканевые культуры

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo .

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита , кори , эпидемического паротита , краснухи , ветрянки . Вследствие угрозы пандемии гриппа , вызываемого Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против

I. Культуры клеток

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу - на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток - это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассо­вой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получа­ют из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полу­ченные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделœения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфек­ций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бес­смертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий бывают первичные клеточные культуры (к примеру, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС - из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых об­наруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформиро­ванными.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачест­венные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa - получена из карциномы шейки матки; Нер-2 - из карциномы гортани; Детройт-6 - из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH - из почки человека.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе росто­вых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, напри­мер, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения всœе пита­тельные среды для культур клеток конструируются на базе сбалансированно­го солевого раствора. Чаще всœего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред - сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и форми­рование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

I. Культуры клеток - понятие и виды. Классификация и особенности категории "I. Культуры клеток" 2017, 2018.

- III. Радиорелейные средства связи

II. Беспроводные средства связи I. Проводные средства связи Ø Городскую телефонную связь Ø Прямая телефонная связь (селекторная)Ø Радиотелефонная связь («Алтай») Ø Индуктивная связь (ЭКВ связь «Дистон», «Нальмэс») Ø... .

- Расход материалов на 1 км дороги с асфальтобетоном покрытием IV типа

Таблица 15 Таблица 14 Таблица 13 Таблица 12 Таблица 11 Дороги Движения по сложным процентам в различные годы эксплуатации Величины коэффициентов m, K0, K0m при росте интенсивности Таблица... .

- III. Время 90 минут.

Занятие №5 Тормозная система Тема №8 Механизмы управления По устройству автомобильной техники Проведения группового занятия План – конспект Преподаватель цикла ПОПОН подполковник Федотов С.А. "____"... .

- Определение Zmin и Xmin из условия отсутствия подрезания

Рис.5.9. О подрезании зубьев колёс. Рассмотрим, как связан коэффициент сдвига x рейки с числом зубьев, которое может быть нарезано рейкой на колесе. Пусть рейка установлена в положении 1(рис.5.9.). В этом случае прямая головок рейки пересечёт линию зацепления N-N в т. и... .

- Verbos que terminan en –ить, -еть

Los verbos irregulares Идти - ir Есть - comer Спать - dormir Хотеть - querer Я Иду Ем Сплю Хочу Ты Идёшь Ешь Спишь Хочешь Он, она Идёт Ест Спит Хочет Мы Идём Едим Спим Хотим Вы Идёте Едите Спите Хотите Они Идут...

Методы культивирования вирусов.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий - облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты - реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод - реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток . Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6-7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек .

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям , которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8-12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки - к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.

ВВЕДЕНИЕ

Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искус­ственных условиях и положили начало глубоким науч­ным исследованиям тканевых культур.

Большая заслуга в деле paзработки методов куль­тивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток жи­вотных в искусственных условиях и тем самым проде­монстрировал их «бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа иссле­дователей под руководством Эрла. Они первые получи­ли рост большого числа клеток на стекле и в жидкой пе­ремешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и ус­пехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для ре­шения различных вопросов биологии и медицины. Од­нако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стиму­лом их развития до современного уровня.

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

1. Виды культур клеток.

Перенесение клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочис­ленных структурных элементов ткани или органа, в состав ко­торых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под конт­роля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особен­ностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.

Живущие вне организма клетки или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и гене­тических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тка­ней in vivo.

В зависимости от методики первичной эксплантации ткани и техники ее культивирования различают несколько видов пе­реживающих и растущих культур тканей и клеток. Наиболь­шее распространение имеют однослойные, а также суспензионные культуры растущих клеток. Именно они составляют основу современной лабораторной и производственной вирусологиче­ской практики.

Различают два основных вида однослойных клеточных куль­тур: первичные и перевиваемые.

Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, по­лученную непосредственно из тканей че­ловека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифиче­ской дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Перио­дическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни пер­вичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут со­хранить способность к росту и размножению. Эти клетки, об­наружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.

Различают линии и штаммы перевиваемых клеток. Первым термином обозначают перевиваемые клетки, характеризующиеся потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидным кариотипом вторым термином - полуперевивае­мые клетки с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и дру­гих клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, являющихся, таким образом, источником всех линий и штаммов перевиваемых клеток.

Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по срав­нению с любой первичной культурой, состоит в потенции неог­раниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.

Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобре­тают способность к автономному существованию, подобно мик­роорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными.

Усовершенствование техники культивирования клеток зна­чительно расширило возможности получения перевиваемых кле­точных линий из самых разнообразных тканей животных и че­ловека. При этом не был обнаружен возрастной предел, выше которого ткани утрачивали бы способность адаптации к неог­раниченному росту in vitro, т.е. к трансформации.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформа­ция клеток происходит in vivo в результате развития патологи­ческого процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной.

Не все злокачественные новообразования способны давать начало перевиваемым клеточным культурам. Так, например, безуспешными были попытки получить перевиваемые клетки из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С тру­дом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскокле­точного рака кожи и слизистых. С другой стороны, сравни­тельно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачест­венных опухолей нервной системы.